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Articulo Científico:
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE UN EXTRACTO DE PROPÓLEO SOBRE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURIFORMES
Londoño O. A., Quintero M. L., Carrillo M. L., García V. S., Mendoza S. M., Ríos A. A., Penieres C. G., Cruz S. T.
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la acción inhibitoria de un extracto etanólico al 15% de propóleo procedente del apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM, sobre el crecimiento de Candida albicans (ATCC 14055), Cryptococcus neoformans, y Aspergillus fumigatus a través de dos pruebas de susceptibilidad: difusión en agar y microdilución. Se impregnaron los discos con el extracto de propóleo. Las pruebas de difusión fueron efectuadas sobre Agar Dextrosa Sabouraud (SDA), Müeller-Hinton con 2% de glucosa y azul de metileno (MH-AM: documento NCCLS M-44A) y RPMI 1640 con agar noble. Para obtener la concentración Inhibitoria mínima (CIM) se realizaron pruebas de microdilución según los métodos M27-A2 (levaduras) y M38-A (filamentosos) del NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standard: ahora Institute for Clinical Laboratory Standard). Se observó actividad inhibitoria sobre el desarrollo de los todos los hongos estudiados. Estos resultados sugieren el posible potencial del propóleo como un tratamiento alternativo contra las infecciones por hongos, tanto levaduriformes como filamentosos. Sin embargo, se requieren más estudios que sustenten dichas observaciones.
INTRODUCCIÓN
El propóleo es un material multifunctional usado por las abejas en la construcción y mantenimiento de sus colmenas. Se ha encontrado que las moléculas farmacológicamente activas del propóleo son flavonoides y ácidos fenólicos y sus ésteres, sin embargo, en un estudio se observó que muestras tropicales que no contenían esas sustancias mostraban actividad similar, lo cual sugiere que se requiere la combinación de diferentes compuestos para su actividad biológica.
Múltiples reportes indican que el propóleo es relativamente no tóxico y tiene diversos efectos sobre bacterias, hongos y virus, así como propiedades antitumorales, entre otros. Sin embargo, se requieren más estudios que sustenten dichas observaciones. Los estudios de la actividad antifúngica del propóleo se han restringido casi exclusivamente al género Candida (5).
Palabras Claves: Propóleo, Bacterias, Actividad Biológica, Hongos.

OBJETIVO
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la acción inhibitoria de un extracto etanólico al 15% de propóleo procedente del apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM, sobre el crecimiento de Candida albicans (ATCC 14055), Cryptococcus neoformans, y Aspergillus fumigatus a través de dos pruebas de susceptibilidad (difusión en agar y microdilución).
METODOLOGÍA
El propóleo es obtenido del apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (figs. 1 y 2) y a partir de éste se prepara un extracto etanólico al 15%.




Figs. 1 y 2. Propóleo obtenido del apiario Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán (flechas: propóleo).
Prueba de difusión en agar:
Para realizar la prueba de difusión en agar, se impregnaron los discos con 25µl del extracto de propóleo. Las pruebas fueron efectuadas sobre Agar Dextrosa Sabouraud (SDA), Müeller-Hinton con 2% de glucosa y azul de metileno (MH-AM) y RPMI 1640 con agar noble (2,3).
Prueba de microdilución:
Para obtener la concentración Inhibitoria mínima (CIM) se realizaron pruebas de microdilución según los métodos M27-A2 (levaduras) y M38-A (filamentosos) del NCCLS, haciendo modificaciones en las diluciones, ya que estos documentos están estandarizados para trabajar con compuestos puros por lo que se emplean concentraciones muy bajas, sin embargo, al trabajar con extractos obtenidos de productos naturales siempre tenemos una mezcla de compuestos y se requiere el empleo de concentraciones mayores. En primer lugar se eliminó el etanol del extracto y el producto resultante se pesó para preparar una solución stock del propóleo con 1600 µg/ml, usando como solvente Dimetil sulfóxido grado analítico (DMSO). A partir de ésta solución se realizaron diluciones, obteniendo concentraciones desde 1 hasta 1024 µg/ml.
Preparación de inóculos.
Para Aspergillus fumigatus se emplearon cultivos de 7 días de crecimiento a 35ºC en agar dextrosa papa (ADP), para inducir la formación de conidios. Se suspendieron los conidios en solución salina fisiológica y se dejaron sedimentar durante 3 a 5 min. Se transfirió el sobrenadante a otro tubo y se agitó vigorosamente durante 15 seg. Se obtuvo una concentración de 1-5x106 conidios/ml, equivalente al 0,5 de Mc Farland (DO de 0.09-0.17, 80-82% de trasmitancia). Se diluyó 1:50 en el medio de prueba RPMI 1640. Para Candida albicans se emplearon cultivos de 24 horas y para Cryptococcus neoformans de 48 horas de incubación en agar dextrosa Sabouraud (SDA). Se resuspendieron las colonias en solución salina fisiológica, ajustando a una densidad equivalente el 0,5 de Mc Farland (1-5x106 UFC/ml). Posteriormente se realizó una dilución 1:1000 con medio RPMI 1640.
Inoculación de microplacas:
Se emplearon microplacas de 96 pozos, con fondo redondo, adicionando en los pozos del 1 al 10 100 µg/ml del inóculo estandarizado y 100 µg/ml de cada dilución. A la columna 11 se le adicionaron 100 µg/ml del inóculo estandarizado y 100 µg/ml del medio de prueba RPMI1640 sin propóleo, lo cual sirvió como control de crecimiento y a la columna 12 se le adicionaron 200 µg/ml del medio de prueba RPMI1640 sin inóculo ni propóleo, lo cual sirvió como control de esterilidad del medio. Las placas se incubaron a 35ºC por 48 horas. C. neoformans puede requerir 72 horas de incubación. Para determinar la concentración fungicida mínima (CFM), se tomaron 10 µl del último pozo que dio positivo (crecimiento mínimo) en la microplaca y de los tres pozos siguientes, que muestran visualmente una inhibición del crecimiento completa, se cultivaron en SDA e incubaron a 35 ºC por 24 o 48 horas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Prueba de difusión en agar:
Se observó actividad inhibitoria sobre el desarrollo de todos los hongos estudiados.
Se obtuvieron halos de inhibición con mayor diámetro empleando MH-AM o RPMI 1640. Se muestran los resultados obtenidos con C. neoformans (tabla 1 y fig. 3).

Tabla 1. Prueba de difusión en agar MH-AM.
DIÁMETRO DE LOS HALOS DE INHIBICIÓN (mm)
C. neoformans
SDA
MH-AM
RPMI 1640
10
20
20
Fig. 3. Prueba de difusión en agar MH-AM. P: Propóleo
Prueba de microdilución:
Las lecturas de las pruebas de microdilución se realizaron a las 24 y 48 horas para todas las cepas, verificando en primer lugar que los resultados obtenidos con los controles fueran los esperados, esto es, que el control negativo estuviera completamente transparente y en el control positivo hubiera suficiente crecimiento. Posteriormente se realizó la lectura de los demás pozos, comparando la cantidad de crecimiento de de cada uno con el crecimiento del control y determinando si hubo o no reducción de crecimiento o en su caso, ausencia de éste. La lectura se realizó de manera visual, considerando: ninguna reducción del crecimiento ++++; ligera reducción del crecimiento o que contiene un 75% de crecimiento comparada con el control positivo +++; una prominente reducción del crecimiento o un 50% comparada con el control positivo ++; poco crecimiento o tan solo el 25% del crecimiento del control positivo + y completamente claro, sin ningún crecimiento comparando con el control positivo 0.También se realizó la lectura espectrofotométrica a 530 nm, agitando previamente las placas para obtener una suspensión homogénea. Para hacer la interpretación de la lectura, se resta a todos los pozos la absorbancia del medio, es decir la del control negativo. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 2. Prueba de microdilución.
CONCENTRACIÓN INHIBITORIA MÍNIMA (CIM) (µg/ml)
Cepa de hongo
Porcentaje de inhibición
100%
80%
50%
C. albicans
512
256
32
C. neoformans
128
64
32
A. fumigatus
128
64
32


Fig. 4. Prueba de microdilución en placa.
Concentración fungicida mínima:
Fig. 5. Determinación de la Concentración Fungicida Mínima (CFM) para A. fumigatus, fue de 256 µg/ml.

Fig. 6. Determinación de la Concentación Fungicida Mínima (CFM) para C. neoformans.
Con 128 µg/ml que fue la CIM se formaron 7 colonias; de acuerdo al NCCLS debe haber menos de tres colonias para ser considerada como CFM.
Desde 1988 se reportó la actividad del extracto etanólico de propóleo contra 23 cepas de levaduras aisladas de diferentes partes del cuerpo humano encontrando que fue fungistático a una concentración de 0.55 mg/ml (8). Otros autores reportaron que la mínima concentración fungicida del extracto etanólico de propóleo contra 15 cepas probadas fue de 3 a 7 mg/ml siendo C. albicans mas susceptible que otras especies como C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii (4). Algunos autores han recomendado la utilización del propóleo como un antiséptico para la prevención y tratamiento de la candidiosis oral incluso, se ha reportado que el extracto etanólico de propóleo podría ser usado como una medicina alternativa en el tratamiento de las candidiosis de pacientes HIV positivos siendo tan efectivo como la nistatina y superando a otros antifúngicos como clotrimazol, econozol y fluconazol (5). Sin embargo, no se han realizado reportes en relación a la actividad sobre otros hongos como fue en este trabajo contra C. neoformans y Asperguillus fumigatus, lo cual sugieren el posible potencial del propóleo como un tratamiento alternativo contra las infecciones por hongos, tanto levaduriformes como filamentosos. Serán de gran relevancia los estudios que se realicen para sustentar éstas observaciones.
CONCLUSIONES.
El extracto etanólico al 15% de propóleo procedente del apiario de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM, tuvo un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Candida albicans (ATCC 14055), Cryptococcus neoformans, y Aspergillus fumigatus. el cual fue demostrado a través de dos pruebas de susceptibilidad: difusión en agar y microdilución, sugiriendo el posible potencial del propóleo como un tratamiento alternativo contra las infecciones causadas no solo por hongos levaduriformes, sino también por hongos filamentosos.
LITERATURA CITADA
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Hazen, K.C. y cols. (2003) Comparison of the susceptibilities of Candida spp. to fluconazole and voriconazole in a 4-year global evaluation using disk diffusion. J. Clin. Microbiol. 41:5623-5632.
Kirkpatrick W.R. y cols(1998) Fluconazole Disk Diffusion Susceptibility Testing of Candida Species Journal of Clinical Microbiology, Nov., p. 3429–3432 Vol. 36, No. 11
Martins R.S. y cols. (2002).. Effect of commercial ethanol propolis extract on the in vitro growth of Candida albicans. J. Oral Sci. 44(1):41-8.
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NCCLS (2002) Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard. NCCLS document M38-A (ISBN 1-56238-470-8). Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2002.
Rojas N, Lugo S.(1988) Efecto antifúngico del propóleos sobre cepas del género Candida. Memorias del I Simposio sobre los Efectos del Propóleos en la Salud Humana y Animal. Varadero, Cuba, 42–53.